Ludger是一家生物科學公司，專門研究糖生物學的醫學應用分析技術。該技術起源于英國牛津大學。它在范圍內用于FDA和EMEA批準的生物藥品的質量控制中，并可用于支持IND提交。我們從1999年開始運營，已建立了一個客戶群，包括*的制藥和生物技術公司。
LudgerTagTM DMB唾液酸試劑盒產品指南
Ludger LT-KDMB-A1說明書
LT-KDMB-A1的質量標準
應用 用于從糖蛋白中釋放唾液酸，并用1,2-二氨基-4,5-亞甲基二氧基苯標記。2HCl(DMB)。
染料性質 相對分子量 = 225.07 gmol-1
熒光，λex = 373 nm，λem = 448 nm。
結構
O NH3Cl
O NH3Cl
同義詞 DMB；1,2-二氨基-4,5-亞甲二氧基苯2鹽酸鹽；1,3-苯并二氧雜-5,6-二胺2鹽酸鹽；5,6-二氨基-1,3-苯并二氧雜唑2鹽酸鹽
描述 該試劑盒含有用于從糖蛋白中釋放唾液酸的試劑。釋放的唾液酸通過胺化環化反應與DMB染料結合。
樣本數量該試劑盒包含用于多達22份樣本的試劑和材料，包括唾液酸參比組以及N-乙酰神經氨酸和N-羥乙酰神經氨酸定量標準品。
樣品量 通常每次分析從50-200µg糖蛋白開始。我們建議一式三份分析樣本。
適用樣本 可以標記糖蛋白、糖肽或聚糖釋放的任何唾液酸。
儲存條件： Store at -18 ℃下避光儲存。避免熱源、光源和濕氣。提供的試劑至少可穩定保存2年。
運輸： 產品可在環境溫度下運輸。
處理： 確保使用的任何玻璃、塑料制品或溶劑不含糖苷酶和環境碳水化合物。所有樣本處理程序均使用無粉手套，并避免環境碳水化合物污染。
單瓶試劑開封后，應立即使用其內容物。根據當地安全規則，丟棄任何多余部分。
安全性： 僅供研究使用。不用于人體或藥物
請閱讀所有所用化學品的安全數據表(SDS)。涉及標記試劑的所有過程均應使用適當的個人安全防護-眼鏡、耐化學腐蝕的手套（例如腈），并在適當的情況下在實驗室通風櫥中進行。
試劑盒內容物
 |
每個試劑盒包含以下各一瓶：
目錄號# | 項目 | 數量 |
LT-DMB-01 | DMB染料 | 0.7 mg |
LT-ACETIC2M-01 | 2摩爾醋酸 | 2 × 1.1 mL |
LT-MERCAPTO-01 | 巰基乙醇的乙酸溶液（1.4摩爾） | 500 µL |
LT-DITHIO-01 | 連二亞硫酸鈉（還原劑） | 4 mg |
CM-NEUAC-01 | N-乙酰神經氨酸定量標準品 | 1 nmol |
CM-NEUGC-01 | N-羥乙酰神經氨酸定量標準品 | 1 nmol |
CM-SRP-01 | 含Neu5Ac、Neu5Gc、 |
|
| Neu5,7Ac2、Neu5Gc、9Ac、Neu5,8Ac2、Neu5,9Ac2和 | 1.25 nmol |
| Neu5,x,xAc3（其中x是未知的乙酰基位置）。 | （總唾液酸） |
所需的其他試劑和設備
Ludger Bioquant糖肽 BQ-GPEP-A2G2S2-10U
貼標時間線
LudgerTag™標記程序，包括干燥時間和唾液酸從
分析樣品，通常需要7小時加上干燥：
程序 時間
樣品制備 10 min + 干燥(1-2 h)，可在前一天進行
唾液酸的釋放 3 h
DMB標記 3.5 h
總時間： 7 h + 干燥
方法
陰性過程對照：樣品緩沖液
不符合唾液酸標準：Neu5Ac(CM-NEUAC-01)、Neu5Gc(CM-NEUGC-01)、唾液酸參比組(CM-SRP-01)小瓶；或Neu5,9Ac2(CM-Neu5,9，Ac-01)（如使用）。
如果需要，酸釋放樣品可在-20 ℃下儲存至少2天[Ref1]。
避免標簽試劑暴露于潮濕和光照條件下，并在60 min內使用。
將樣品、對照品和標準品置于設定為50 ℃的烘箱中，并在 黑暗。
孵育期間，您可以開始調節LC，以備分析-參見第4節。
向各唾液酸標準品中加入480µL水
稀釋用于標準曲線的Neu5Ac和Neu5Gc標準品（使用表1作為指導，因為Neu5Gc的含量通常低于Neu5Ac，Neu5Gc曲線的范圍比Neu5Ac低一個步驟）。混勻。
這可以在“HPLC條件色譜柱”運行正在進行時完成。
比率 | 稀釋度 因子 | Neu5Ac標準品(µL) | 水 (µL) |
| Neu5Gc標準品(µL) | 水(µL) |
1:0 | 1 | 200 | 0 | - | - | |
1:1 | 2 | 100 | 100 | 100 | 100 | |
1:4 | 5 | 40 | 160 | 40 | 160 | |
1:9 | 10 | 20 | 180 | 20 | 180 | |
1:49 | 50 | 10 | 490 | 10 | 490 | |
1:99 | 100 | 10 | 990 | 10 | 990 | |
1:999 | 1000 | 以1:99稀釋20份（預混） | 180 | 20來自1:99 （預混） | 180 | |
1:4999 | 5000 | - | - | 10來自1:49 （預混） | 990 |
表1.標準品的稀釋方案
注：如果已知樣品具有低水平的唾液酸化（例如IgG）-則不要用水稀釋。如果發現LC峰面積不在標準曲線范圍內，則制備濃度更高的樣品或延長標準曲線。
樣品在自動進樣器中于10 ℃避光條件下可穩定至少72 h[Ref2]。
溶劑B = 乙腈
熒光：激發波長：373 nm；發射波長：448 nm；柱溫 = 30 ℃；樣品溫度 = 10 ℃
時間(min) | 流速(mL/min) | %A | %B |
0 | 0.5 | 100 | 0 |
19 | 0.5 | 100 | 0 |
19.5 | 0.5 | 10 | 90 |
23.5 | 0.5 | 10 | 90 |
24 | 0.5 | 100 | 0 |
30 | 0.5 | 100 | 0 |
表2.采用LudgerSep-R1色譜柱（4.6 x 150 mm，3µm顆粒）LS-R1-4.6 x 150進行HPLC分析的30 min運行方法。
進樣量 = 25µL。
時間(min) | 流速(mL/min) | %A | %B |
0 | 0.25 | 100 | 0 |
7 | 0.25 | 100 | 0 |
7.5 | 0.25 | 10 | 90 |
8 | 0.25 | 10 | 90 |
8.5 | 0.25 | 100 | 0 |
15 | 0.25 | 100 | 0 |
表3使用LudgerSep-uR2色譜柱（2.1 x 100 mm，1.9
µm微粒）LS-UR2-2.1 x 100。
進樣量 = 5µL。
SRP |
標準曲線的Neu5Gc稀釋 |
用于標準曲線的Neu5Ac稀釋液 |
工藝控制（胎球蛋白；GPEP；水；緩沖液） |
樣品 |
標準曲線的Neu5Gc稀釋 |
用于標準曲線的Neu5Ac稀釋液 |
SRP |
表4.樣品進樣順序
例如：±0.1 min。
 |
（這是通過定量NMR測定的量±20%）
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00
分鐘
圖1：在LudgerSep-R1 HPLC色譜柱上運行的DMB標記唾液酸參比組(CM-SRP-01)的色譜圖。
峰：1 = Neu5Gc； 2 = Neu5Ac； 3 = Neu5,7Ac2； 4 = Neu5Gc，9Ac； 5 = Neu5,8Ac2； 6 = Neu5,9Ac2；7 = Neu5,x,xAc3（其中x是未知的乙酰基位置）；* = 試劑。
注：該色譜圖僅作為示例提供。峰寬、分離度和保留時間取決于您實驗室的HPLC系統設置。
0.00 1.25 2.50 3.75 5.00 6.25 7.50
分鐘
圖2：在LudgerSep-uR2 UHPLC色譜柱上運行的DMB標記唾液酸參比組。
峰：1 = Neu5Gc； 2 = Neu5Ac； 3 = Neu5,7Ac2； 4 = Neu5Gc，9Ac； 5 = Neu5,8Ac2； 6 = Neu5,9Ac2；7 = Neu5,x,xAc3（其中x是未知的乙酰基位置）；* = 試劑。
注：該色譜圖僅作為示例提供。峰寬、分離度和保留時間取決于您實驗室的UHPLC系統設置。
參考文獻和相關文獻
反應機制
標記反應是一個2步過程。
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故障排除
標記方法。如果懷疑鹽干擾樣本，分析前在無鹽溶劑中透析樣本。
如果校準標準品在相同條件下儲存并同時進行分析，則在10 ℃下避光儲存長達72小時[參考文獻3]。如果不可能，則DMB標記的樣本可以冷凍長達2天[參考1]。
和色譜圖上的額外峰。對于唾液酸化水平較低的樣品（將大量蛋白進樣至色譜柱中），這可能更成問題。用正常流動溶劑和乙腈的10:90混合物在正常流速下清洗色譜柱。
評估您是否使用UHPLC，是“強/弱清洗”。這些可能對色譜產生顯著影響。作為一般規則，“弱清洗”使用弱梯度條件，“強清洗”使用強梯度條件。您需要評估其中哪些提供了與產品指南相匹配的SRP跟蹤。我們建議通過以下方式開始LC優化 弱洗液。
保證和責任
Ludger保證上述產品符合隨附的分析文件。如果產品因誤用以外的原因失效，Ludger將根據其選擇免費更換或退還購買價格。本保證是排他性的，Ludger不作任何其他明示或暗示保證，包括任何暗示條件或任何特定用途的適銷性或適用性保證。
Ludger不對任何附帶、后果性或或或或有損失負責。本品僅用于體外研究。
