squarix ME043.1說明書 

目錄號編號ME043.1（RPA.1）(1 mg)

目錄號編號ME043.2（RPA.2）(5 mg)

羅丹明 B-[（1,10-二氮雜菲-5-基）-氨基羰基] 芐酯

• Fe2 + 特異性熒光“傳感器”
• 線粒體特異性
• 線粒體可螯合鐵池的測定
• 線粒體鐵攝取評估
• 病理狀態下線粒體可螯合鐵池改變的評估
• 線粒體可螯合鐵對生理和病理細胞過程的作用評估
• 鐵減少評估

熒光“鐵傳感器”RPA 和 RDA 選擇性測定活細胞線粒體可螯合鐵

鐵對許多生物過程至關重要，但也是有害的，因為它促進產生高度破壞性的氧物種。線粒體可螯合鐵被認為是導致幾種人類疾病。過去，由于線粒體蓄積不足或鐵選擇性指標的細胞分布均勻，試圖測定可螯合鐵的線粒體內池存在問題 (Lit 3)。熒光無毒的“鐵傳感器”RPA 和 RDA 是一個，它允許在單個完整線粒體中特異性地確定這種鐵池。它們是評估不穩定（“氧化還原活性”）鐵功能的新工具，例如在自由基參與的細胞和組織損傷過程中。

產品信息

RPA 作為生物樣品中 Fe (Ⅱ) 的選擇性、高量子產率熒光標記物。透膜化合物的陽離子熒光團允許通過例如熒光顯微鏡進行觀察，并且基于線粒體的負膜電位，特別是靶向活細胞的線粒體。在無細胞系統中，RPA 熒光 (max 601 nm) 被 Fe2 + 離子強烈化學計量淬滅。

1,2

1

0,8

0,6

A

例如：564 nm 發射：603 nm

120 B

100 ·

80 ·

60

RPA (µM)

• 45

0,4

30

40

20 · ·

0,2       20

0 0

· · ·

· · · · ·

450 550 650 750

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

FAS (µM)

A：無細胞系統中 RPA（20 MRPA 的“簡單緩沖液”(SBS)：2 mM 抗壞血酸鹽、0.15%SDS 和 10 mM Tris/HCl，pH 8.2）的吸光度和發射光譜。

B：Fe2 + 對“SBS”中 RPA (20-45 M) 熒光的影響：Fe2 +，作為添加的儲備液 (1 mM) 中硫酸亞鐵銨/檸檬酸三鈉鹽二水合物 (FAS) 濃度的增加添加。含 20 mM 抗壞血酸鹽，與培養基混合。在 RPA/Fe2 + 復合物*形成后 2 min，測定含已知濃度 RPA 和 Fe2 + 的培養基部分的熒光（以任意單位 a.u. 表示）。零熒光等于無染料培養基的熒光。

RPA 選擇性蓄積在培養肝細胞的線粒體中 (Lit 1,2)。當鐵以膜滲透形式加入細胞時，線粒體內 RPA 熒光被淬滅。當實驗可用的線粒體可螯合鐵時，其增加

加入透膜過渡金屬螯合劑吡哆醛異煙酰腙和 1,10-二氮雜菲后，膜透性降低。這種 RPA 熒光的增加允許使用離體原位校準 (Lit 1) 特異性定量活細胞中的線粒體可螯合鐵。

在細胞系統中的應用

RPA 可按 Lit 所述使用。1. 在蓋玻片或 Pentz 小室培養的活細胞與 RPA（0.01-10µM，由 10µM 或 1 mM DMSO 儲備液制備）在 HBBS（“Hanks 平衡 sot 溶液”）中于 37 ℃ 孵育 10-12 min。隨后用無染料 HBBS 清洗細胞 3 次。為了避免 RPA 與小室結合并改善線粒體負荷，RPA 負荷后應將細胞轉移到第二個（無指示劑）Pentz 小室，再孵育 15 min。在 37 °C 條件下。現在應在 37 °C 條件下用適當的培養基（例如肝細胞用 HBBS 或 L-15 培養基）覆蓋細胞。使用例如定量激光掃描顯微鏡測定線粒體內 RPA 熒光。RPA 的紅色熒光在 exc. = 543 nm 處激發，并通過 exc. = 601 nm 附近的長通濾光片收集。定量和定性測量的掃描參數取決于用于實驗的顯微鏡系統。通過加入 FeCl3/8-羥基喹啉復合物 (5-15µM) 或膜滲透性鐵螯合劑，例如 PIH（吡哆醛異煙酸腙，2 mM）或 1,10-二氮雜菲 (2 mM)，開始測定后 5-10 min 可控制可螯合鐵的線粒體內水平。對于對照測量，平行培養物上樣含有相同熒光團的鐵不敏感對照 RPAC（羅丹明 B-[（菲-9-基）氨基羰基] 芐基酯）。應使用與上述相同的加載條件。

原位校準

通過比較 PIH (2 mM)“去淬滅”后的線粒體熒光（任意單位）與溶解在“線粒體培養基”中的 RPA 標準品 (5-80µM) 的熒光，測定線粒體內 RPA 濃度的離體校準（組成見文獻 1）。為了獲得校準曲線，將 100µl 已知 RPA 濃度的培養基部分置于細胞實驗中使用的相同蓋玻片上。在無細胞離體測量中，使用與細胞熒光定量測量相同的焦平面和激光掃描參數。

Fe2 + 誘導 RPA 熒光猝滅的離體標定

1 mL“線粒體培養基”（見 Lit.1）轉移至 1.5 mL 試管中，37 ℃ 孵育。加入 RPA (20-80µM)。加入新鮮制備的含 20 mM 抗壞血酸鹽的貯備液 (1 mM) 中已知濃度的 FAS（硫酸亞鐵銨/檸檬酸三鈉鹽二水合物）。RPA/Fe2 + 在應用期間形成。2 min 孵育時間。通過使用與細胞熒光定量測量和離體校準相同的焦平面和激光掃描參數測量 RPA 熒光，獲得校準曲線。

產品數據

產品名稱： RPA

產品代碼： ME043.1 (1 mg) 和 ME043.2 (5 mg)

化學名稱： 羅丹明 B-[（1,10-二氮雜菲-5-基）-氨基羰基] 芐酯

分子式： C48H44N5O4Br

分子量： 834g/mol

大吸收： max (log) = 564 nm (4.95) ,510-535 寬肩峰

發射大值： 大值 601 nm

穩定性： < 4 ℃，干燥避光儲存

外觀： 紫色固體

純度： > 97% (1H NMR，500 MHz)

淬滅化學計量學： RPA/Fe2 + :3:1[mol/mol]

體外毒性： 無毒

使用注意事項

該產物作為生物樣品中 Fe (Ⅱ) 的選擇性、高量子產率熒光標記物，尤其是在活細胞的線粒體中。可通過熒光光譜法、熒光板進行測量  讀者，  FACS，  視頻顯微鏡  和  激光掃描顯微鏡。  可在 DMSO 中制備 1 mM-5 mM RPA 儲備液，等份試樣應在-20 ℃ 避光保存。當在-20 ℃ 下適當儲存時，溶液可使用至少 2-3 個月。

訂購信息

*有關散裝包裝規格，請咨詢。價格不含運費，請咨詢。 后更新日期：2020 年 1 月

文獻

1. 用新型熒光傳感器選擇性測定活細胞線粒體可螯合鐵；

F. Petrat 等人生物化學。J. (2002) 362,137-147

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2. 活細胞中的可螯合鐵池：系統確定的量；F. Petrat et al.生物學化學，第 383 卷，第 489-502 頁，2002 年
3. 利用不同鐵結合親和力的線粒體選擇性熒光鐵指示劑評估可螯合線粒體鐵。U. Rauen 等人ChemBioChem 2007,8,341-352
4. 線粒體烏頭酸酶的氧化失活導致大鼠原代中腦培養物中鐵和 H2O2 介導的神經毒性。David Cantu 等人PlosOne，2009 年 9 月，第 4 卷，第 9 期，第 1-9 頁
5. Tryparedoxin 過氧化物酶缺陷使錐蟲發生鐵噬型細胞死亡。M. Bogacz 等人細胞生物學，2018 年 7 月
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